Caracterización del daño morfológico en el área ca1 del hipocampo y deterioro funcional secundario a isquemia cerebral global en ratas envejecidas.

Tesis (Doctor en Medicina) UANL, 2014.

Estudo sobre o papel da HSP27 na tolerância à isquemia cerebral em um modelo in vivo e em culturas organotípicas de hipocampo de ratos

A HSP27 é um membro da família das proteínas de choque térmico que protege as células contra diversos tipo de estresse, sendo expressa principalmente em astrócitos depois da isquemia. Neste trabalho, nós estudamos o papel da HSP27 na tolerância à isquemia cerebral, usando um modelo in vivo e culturas organotípicas. Foram estudados diferentes tempos de reperfusão in vivo (1, 4, 7, 14, 21, 30 dias) usando 2 min, 10 min ou 2+10 min de isquemia global transitória pela oclusão dos 4 vasos (4VO). Foi observado um aumento no imunoconteúdo no DG depois de todos os tratamentos, com uma diminuição na porcentagem de HSP27 fosforilada. Em CA1, região vulnerável, observou-se um aumento no imunoconteúdo depois de 10 ou 2+10 min de isquemia; em 10 min o aumento de fosforilação foi paralelo ao imunoconteúdo, enquanto com 2+10min de isquemia, quando a região CA1 se tornou resistente, houve uma diminuição na porcentagem de HSP27 fosforilada. Os resultados sugerem que a HSP27 pode estar atuando como chaperona, protegendo outras proteínas da desnaturação nos astrócitos, os quais podem auxiliar os neurônios a sobreviverem por manter a homeostase do tecido. Em culturas organotípicas, foram usados 5 ou 10 min de privação de glicose e oxigênio (OGD) ou 1µM de NMDA para induzir tolerância ao tempo letal, 40 min, de privação de glicose e oxigênio (OGD). Nesse caso, foi observado um aumento no imunoconteúdo de HSP27 depois de todos os tratamentos, mas a porcentagem de HSP27 fosforilada se manteve constante ou aumentou quando o pré-condicionamento ocorreu. A HSP27 pode estar modulando os filamentos de actina ou bloqueando o processo apoptótico, facilitando a sobrevivência das células. Em conjunto, os resultados sugerem que o mecanismo que leva à morte de células pode ser diferente nos dois modelos, exigindo atuações distintas da proteína.

Estrógeno e pré-condicionamento : efeitos neuroprotetores e possíveis mecanismos de ação em modelos in vitro e in vivo de isquemia cerebral

As bases moleculares da neuroproteção contra a isquemia mediada por estrógeno continuam obscuras, assim como os mecanismos envolvendo a tolerância ao dano isquêmico subseqüente induzida por pré-condicionamento. Neste trabalho foi estudado se as vias de sinalização celular da PI3-K (fosfatidil inositol 3-quinase) e da MEK/ERK 1/2 estariam envolvidas na neuroproteção induzida por estrógeno, bem como alguns parâmetros de estresse oxidativo, especificamente o conteúdo de radicais livres, um índice de dano oxidativo a proteínas e a capacidade antioxidante total. Também foi estudado o possível envolvimento dos transportadores de glutamato (EAAT1 e EAAT2) e dos receptores de estrógeno (ERα e ERβ) nos efeitos neuroprotetores do estrógeno e do pré-condicionamento. Para este fim, foram utilizados os modelos in vitro de culturas organotípicas de fatias hipocampais e fatias hipocampais preparadas a fresco expostas à privação de oxigênio e glicose (POG) e o modelo in vivo de hipóxia-isquemia neonatal. Em culturas tratadas tanto aguda como cronicamente com 17β-estradiol, a morte celular induzida por POG foi diminuída acentuadamente quando comparada com as culturas tratadas apenas com veículo. Este efeito neuroprotetor foi evitado por LY294002 (inibidor de PI3-K), mas não por PD98059 (inibidor de MEK/ERK 1/2). Ambos os protocolos de tratamento com estradiol induziram a fosforilação/ativação da proteína quinase B (PKB/Akt) e a fosforilação/inativação da glicogênio sintase quinase-3β (GSK-3β). Em um estudo similar, o imunoconteúdo do receptor estrogênico ERα diminuiu após POG em culturas tratadas tanto com estradiol quanto veículo, enquanto que o receptor ERβ aumentou apenas nas culturas tratadas com estradiol expostas ou não à POG. Não foram observadas alterações no imunoconteúdo dos transportadores de glutamato (EAATs) em nenhum dos tratamentos in vitro. Em fatias de hipocampo de cérebro de ratas ovariectomizadas que receberam reposição de estradiol, a morte celular foi reduzida em comparação ao grupo de ratas que não recebeu a reposição hormonal. Neste mesmo modelo, observou-se que a POG aumentou a produção de radicais livres nos dois grupos, porém não foram observadas diferenças na capacidade antioxidante total. Por outro lado, a reposição de estradiol evitou a redução nos conteúdos de triptofano e tirosina causada por POG. No modelo in vivo, o cérebro de ratos neonatos foi protegido contra a hipóxia-isquemia pelo précondicionamento hipóxico. Em paralelo, o pré-condicionamento aumentou o imunoconteúdo dos transportadores de glutamato EAAT2 e do receptor estrogênico ERα em córtex e diminuiu os níveis de EAAT2 em estriado, mas não afetou os níveis de EAAT1 e ERβ. Já no modelo in vitro de pré-condicionamento, nas culturas organotípicas de hipocampo pré-condicionadas, 15 min de POG induziu tolerância acentuada a um período subseqüente de 45 min de POG, porém não foram detectadas alterações nos transportadores de glutamato nem nos receptores estrogênicos. Juntos, os resultados sugerem que na isquemia a neuroproteção induzida por estrógeno pode envolver a via de sinalização celular da fostatidil inositol 3-quinase (PI3-K), a prevenção do dano oxidativo a proteínas e a regulação dos receptores estrogênicos ERα e ERβ, enquanto que a tolerância à isquemia cerebral induzida por pré-condicionamento pode envolver a regulação dos transportadores de glutamato EAAT2 e receptores estrogênicos ERα.

Efeito neuroprotetor do resveratrol em modelo in vitro de isquemia cerebral : envolvimento das vias PI3-K e MAPK

O cérebro é altamente dependente de um fluxo sanguíneo contínuo para suprimento de oxigênio e glicose, e por esta razão, eventos isquêmicos resultam em grande degeneração celular. O resveratrol é um antioxidante natural encontrado nas uvas e no vinho tinto que possui efeitos antitumoral e antiinflamatório, bem como propriedades cardioprotetoras. Neste trabalho, nós avaliamos o efeito neuroprotetor do resveratrol em um modelo in vitro de isquemia cerebral. Além disso, nós investigamos se este efeito estava correlacionado com as vias de sinalização da fosfoinositol3-quinase (PI3-k) e da proteína quinase ativada por mitógenos (mitogen-activated protein kinase-MAPK), ambas envolvidas na regulação da proliferação e sobrevivência celular. Para isto, nós usamos cultura organotípica de hipocampo exposta à privação de oxigênio e glicose (POG) como modelo de isquemia cerebral. A morte celular foi quantificada pela medida da incorporação de iodeto de propídeo (IP), um marcador de células mortas. Nas culturas expostas à POG na presença do veículo, aproximadamente 46% do hipocampo foi marcado com IP, indicando uma alta porcentagem de morte celular. Quando as culturas foram tratadas com resveratrol 10, 25 e 50µM, a morte celular foi reduzida para 22, 20 e 13%, respectivamente. Para elucidar o mecanismo pelo qual o resveratrol exerce seu efeito neuroprotetor nós investigamos a via PI3-k usando o inibidor LY294002 (5µM) e a via MAPK usando o inibidor PD98059 (20µM). A neuroproteção mediada pelo resveratrol (50µM) foi prevenida pelo LY294002, mas não pelo PD98059. A análise por immunoblotting revelou que o resveratrol 50µM induziu a fosforilação/ativação da Akt, a fosforilação/inativação da glicogênio sintase quinase-3β (GSK-3β) 1, 6 e 24 h após a POG e a fosforilação/ativação da quinase regulada por sinais extracelulares (extracellular signal-regulated kinase-1 and -2-ERK1/2) 6 e 24 h após a POG. Juntos, o aumento da fosforilação da Akt e GSK-3β induzida pelo resveratrol após a POG e o efeito da inibição da PI3-k pelo LY294002 levando a diminuição da neuroproteção mediada pelo resveratrol, sugerem que a via PI3-k/Akt, associada à GSK-3β , estão envolvidas no mecanismo pelo qual o resveratrol protege as culturas organotípicas da morte celular.

Dual studies on autonomic function and cerebral autoregulation in ischemic stroke patients

Tese de mestrado, Neurociências, Faculdade de Medicina, Universidade de Lisboa, 2015

Caracterização da morte celular em neurônios da região CA1 do hipocampo de ratos submetidos à isquemia global transitória e reperfusão

A caracterização da morte neuronal após injúria neuronal aguda é um assunto muito discutido e que está sob constante investigação. O presente estudo tem por objetivo caracterizar a morte celular na camada de células piramidais da região CA1 do hipocampo após 10 minutos de isquemia e períodos precoces de reperfusão, utilizando a microscopia eletrônica da transmissão. O modelo animal empregado para produzir a isquemia prosencefálica foi o de oclusão dos 4 vasos com modificações (Netto et al, 1993). Após 3, 6, 12 e 24 h de reperfusão, os animais eram anestesiados e perfundidos transcardiacamente. Os encéfalos eram removidos e seccionados. Os cortes contendo o hipocampo eram desidratados, incluídos em resina, seccionados, observados no microscópio eletrônico de transmissão e eletromicrografados. As células piramidais da região CA1 do hipocampo de todos os grupos submetidos à isquemia apresentavam alterações morfológicas. Em tempos precoces de reperfusão as alterações eram menos expressivas quando comparadas a maiores tempos de reperfusão, e envolviam sinais de necrose apoptótica e necrose oncótica. Com 12 h de reperfusão, as células apresentavam uma aparente recuperação. Decorridas 24 h do insulto isquêmico, o dano neuronal era mais severo e incluía sinais de necrose oncótica, assim como, corpos apoptóticos, os quais caracterizam a morte celular por necrose apoptótica É possível que as células no período pós-isquemia passem por um processo conhecido como um continnum entre a apoptose e a necrose, ou, um processo denominado parapoptose. A aparente recuperação ocorrida com 12 h de reperfusão pode dever-se à influência das células gliais, em especial das células astrocitárias. Dessa forma, o presente estudo fornece evidências que a morte celular após evento isquêmico global transitório, em ratos Wistar adultos envolve características de necrose apoptótica e necrose oncótica.

Sobrevivência e dispersão de células da fração mononuclear da medula óssea transplantadas heterologamente no estriado após isquemia experimental

Estudos experimentais evidenciam o potencial promissor das células da fração mononuclear da medula óssea (CMN-MO) no tratamento de modelos de isquemia cerebral. Sabe-se que as CMN-MOs são sensíveis à modificações microambientais, tal qual aquelas induzidas por uma isquemia, como eventos associados à inflamação. Contudo, pouco se conhece a respeito da biodistribuição e sobrevida dessas células no tecido nervoso pós-lesão. Objetiva-se investigar se a sobrevivência e a disseminação das CMN-MOs são influenciadas pela resposta inflamatória após isquemia estriatal. Parecer CEPAE, protocolo nº 073/12. Transplante heterólogo (5x105 de CMN-MOs) no estriado de ratos Wistar, agrupados entre controles não-tratados (IST) e falso-operado (FO) e tratados (ITCM), perfundidos em 1, 3, 7 e 28 dias. CMN-MO foram impregnadas com Nanocristais Qdot para posterior identificação por microscopia de fluorescência no tecido do receptor. Coloração, por violeta de cresila, e imunoistoquímica básica (IBA1 e ED1) foram aplicadas para análise histopatológica do tecido em microscopia de luz. Testes neurocomportamentais (teste de remoção do adesivo e teste do cilindro) foram realizados para aferir a resposta dos grupos às intervenções. Os achados histopatológicos evidenciam a eficiência do modelo experimental de indução isquêmica em reproduzir a lesão no estriado dorsolateral. O infiltrado celular no grupo IST marca a resposta inflamatória, posteriormente confirmada por imunoistoquímica para ED1 e IBA1; o infiltrado celular no grupo ITCM, evidencia a permanência das CMN-MO em todas as sobrevidas estudadas. O perfil de perda por morte das CMN-MO transplantadas no sítio de lesão é semelhante entre os grupos ITCM e FO, contudo, evidencia que resposta inflamatória do receptor causa maior decaimento do montante celular no grupo ITCM. Procedimentos de infusão celular mais refinados ou automatizados podem melhorar a sensibilidade dos testes comportamentais para discriminar a evolução entre os grupos estudados. Conclui-se que a alteração do microambiente pós-isquemia cria condições que determina a dispersão e a sobrevivência das CMN-MO. Outras análises de imunoistoquímicas podem apontar resultados quanto ao perfil microglial presentes nas sobrevidas estudadas e o grau de imunomodulação pelo estudo da dinâmica das citocinas inflamatórias produzidas.

Correlação entre a escala internacional de acidente vascular cerebral do Instituto Nacional de Saúde (NIHSS) e a penetração laríngea e aspiração laringotraqueal no acidente vascular cerebral isquêmico

Pós-graduação em Bases Gerais da Cirurgia - FMB

Pre, intra and post-ischemic hypothermic neuroprotection in temporary focal cerebral ischemia in rats: morphometric analysis

Objective: To evaluate the neuroprotection of mild hypothermia, applied in different moments, in temporary focal cerebral ischemia in rats. Methods: Rats was divided into Control (C), Sham (S), Ischemic-control(IC), Pre-ischemic Hypothermia (IH1), Intra-ischemic Hypothermia (IH2), and Post-ischemic Hypothermia (IH3) groups. Morphometry was performed using the KS400 software (Carl Zeiss (R)) in coronal sections stained by Luxol Fast Blue. Ischemic areas and volumes were obtained. Results: Statistically, blue areas showed difference for C vs. IC, IC vs. IH1 and IC vs. IH2 (p=0.0001; p=0.01; p=0.03), and no difference between C vs. S, IC vs. IH3 and IH vs. IH2 (p=0.39; p=0.85; p=0.63). Red areas showed difference between C vs. IC, IC vs. IH1 and IC vs. IH2 (p=0.0001; p=0.009; p=0.03), and no difference between C vs. S, IC vs. IH3 and IH1 vs. IH2 (p=0.48; p=0.27; p=0.68). Average ischemic areas and ischemic volumes showed difference between IC vs. IH1 and IC vs. IH2 (p=0.0001 and p=0.0011), and no difference between IC vs. IH3 and IH1 vs. IH2 (p=0.57; p=0.79). Conclusion: Pre-ischemic and intra-ischemic hypothermia were shown to be similarly neuroprotective, but this was not true for post-ischemic hypothermia.

Hipocapnia en neuroanestesia : estado actual

La hiperventilación ha sido una maniobra común en el manejo anestésico de procedimientos neuroquirúrgicos. Hace unos años existía el escepticismo médico si esto resultaba en isquemia cerebral, hoy sabemos que es perjudicial y deteriora el estado y pronóstico del paciente.

Efeito in vivo e in vitro da prolina sobre a atividade da Na+, K+-ATPase de cérebro de ratos

A hiperprolinemia tipo II é um erro inato do metabolismo de aminoácido causado pela deficiência na atividade da Ä1 pirrolino-5-carboxilato desidrogenase. O bloqueio dessa reação resulta no acúmulo tecidual de prolina. A doença caracteriza-se fundamentalmente por epilepsia, convulsões e um grau variável de retardo mental, cuja etiopatogenia ainda é desconhecida. No tecido nervoso, a Na+, K+ - ATPase controla o ambiente iônico relacionado com a atividade neuronal, regulando o volume celular, o fluxo de íons e o transporte de moléculas ligadas ao transporte de Na+, tais como, aminoácidos, neurotransmissores e glicose. Evidências na literatura mostram que recém nascidos humanos com baixos níveis de Na+, K+ -ATPase cerebral apresentam epilepsia e degeneração espongiforme. Alterações na atividade desta enzima têm sido associadas a várias doenças que afetam o sistema nervoso central, como isquemia cerebral e doença de Parkinson. Considerando que a inibição da Na+, K+ - ATPase por ouabaína tem sido associada com liberação de neurotransmissores, incluindo glutamato, em uma variedade de preparações neuronais, e que alguns autores sugerem que o efeito da prolina sobre a sinapse glutamatérgica possa ser, pelo menos em parte, responsável pelos sintomas neurológicos encontrados nos pacientes com hiperprolinemia, no presente trabalho verificamos efeitos dos modelos experimentais agudo e crônico de hiperprolinemia tipo II sobre a atividade da Na+, K+ - ATPase de membrana plasmática sináptica de córtex cerebral e hipocampo de ratos. No modelo crônico, a prolina foi administrada a ratos Wistar duas vezes ao dia do 6o ao 28o dia de vida, enquanto que no modelo agudo os animais, com 15 dias de vida, receberam uma única injeção de prolina e foram sacrificados 1hora após a administração da droga. Os animais tratados crônicamente com prolina não apresentaram alterações significativas no peso corporal, do encéfalo, do hipocampo e do córtex cerebral, bem como nas quantidades de proteínas do homogenizado cerebral e da membrana plasmática sináptica de córtex cerebral e hipocampo. Nossos resultados mostraram uma diminuição significativa na atividade da Na+, K+ - ATPase de membrana plasmática sináptica de cérebro de animais tratados aguda e crônicamente com prolina. Foram também testados os efeitos in vitro da prolina e do glutamato sobre a atividade da Na+, K+- ATPase. Os resultados mostraram que os dois aminoácidos, nas concentrações de 1,0 e 2,0 mM, inibiram significativamente a atividade da enzima. O estudo da interação cinética entre prolina e glutamato, sugere a existência de um sítio único de ligação na Na+, K+ - ATPase para os dois aminoácidos. É possível que a inibição na atividade da Na+, K+- ATPase possa estar envolvida nos mecanismos pelos quais a prolina é neurotóxica. Acreditamos que nossos resultados possam contribuir, pelo menos em parte, na compreensão da disfunção neurológica encontrada em pacientes com hiperprolinemia tipo II.

Avaliação da atividade neuroprotetora do extrato de kava (Piper methysticum) em modelos in vitro de lesão celular

As doenças cerebrovasculares, popularmente conhecidas como derrames, são uma das principais causas de morbidade e mortalidade entre adultos e idosos. Contudo, muitos pacientes que sofrem derrame sobrevivem e experimentam as conseqüências do insulto por muitos anos, muitas vezes a nível emocional, motor ou intelectual. Dentre estas lesões, destaca-se a isquemia cerebral. Existem modelos experimentais de isquemia cerebral in vivo e in vitro. Os modelos in vitro são realizados em culturas ou fatias de tecido cerebral submetidas à Privação de Oxigênio e Glicose (POG), que mimetizam condições traumáticas similares, mas não idênticas às produzidas in vivo. A investigação da atividade de substâncias potencialmente neuroprotetoras a partir da comparação da morte celular entre culturas ou fatias de tecido cerebral controle e tratadas é facilitada neste tipo de modelo experimental. Após a injúria, as culturas são expostas a métodos de avaliação da viabilidade ou dano celular como, por exemplo, o corante fluorescente iodeto de propídeo, que marca seletivamente células mortas ou em curso de morte, ou MTT (3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazoliumbromide) que mede a viabilidade mitocondrial possibilitando uma posterior quantificação. As plantas são uma fonte importante de produtos naturais biologicamente ativos, muitos dos quais se constituem em modelos para a síntese de um grande número de fármacos. Um exemplo é a planta kava-kava ou somente kava (Piper Methysticum) a qual chamou a atenção dos pesquisadores devido à sua utilização nas ilhas do Pacífico sul. Foi demonstrada a possibilidade da kava possuir uma variedade de atividades farmacológicas importantes, entre elas a atividade de neuroproteção Esse trabalho tem como objetivo avaliar a atividade neuroprotetora do extrato de kava-kava (Piper methysticum) em modelos in vitro de morte neuronal em fatias de hipocampo de ratos, investigar o envolvimento da proteína de choque térmico HSP27 (Heat Shock Protein) no processo de morte e neuroproteção induzida pela kava, bem como investigar o efeito da lesão induzida por POG sobre o imunoconteúdo da proteína Oxido Nítrico Sintase induzível (iNOS). Os resultados dos experimentos por nós realizados nas culturas organotípicas submetidas à POG por 40 minutos e tratadas com extrato de kava (7µg/ml) demonstraram uma significativa redução, na ordem de 58% na intensidade da morte neuronal na região CA1 do hipocampo em resposta à injúria. Em fatias hipocampais submetidas à POG por 60 minutos a adição do extrato de kava 7µg/ml aumentou em 15% a viabilidade celular, confirmando a atividade neuroprotetora sugerida para esta planta. As culturas expostas à POG e tratadas com kava apresentaram um aumento significativo no imunoconteúdo da proteína HSP27, esse aumento é acompanhado de um aumento da fosforilação, uma vez que a percentagem de proteína fosforilada se mantém igual. As fatias lesionadas tratadas com kava apresentaram uma diminuição significativa no imunoconteúdo da iNOS na ordem de 35 % em relação as fatias lesionadas tratadas com DMSO (Dimetilsulfoxido). Estes dados podem sugerir que um dos mecanismos da neuroproteção observada para o extrato de kava, possa envolver essas proteínas.

Alterações bioquímicas e comportamentais em ratos submetidos ao modelo químico experimental de hiperhomocisteinemia

A homocistinúria é uma doença metabólica hereditária causada pela deficiência severa na atividade da enzima cistationina β-sintase e é bioquimicamente caracterizada pelo acúmulo tecidual de homocisteína e metionina. Retardo mental, deficiência cognitiva, isquemia, convulsões e aterosclerose são achados clínicos comuns em pacientes homocistinúricos. No entanto, os mecanismos fisiopatológicos da doença são pouco conhecidos. Modelos animais experimentais de erros inatos do metabolismo são úteis para compreender a fisiopatologia dessas doenças em humanos. No nosso laboratório, já foram criados alguns modelos animais de algumas doenças metabólicas hereditárias, como, por exemplo, fenilcetonúria e hiperprolinemia tipo II. A Na+,K+-ATPase é uma enzima fundamental responsável pela manutenção do gradiente iônico necessário para a excitabilidade neuronal e consome de 40 a 60% do ATP formado no cérebro. Essa enzima é inibida por radicais livres e sua atividade está diminuída na isquemia cerebral, epilepsia e em doenças neurodegenerativas como a doença de Alzheimer. A diminuição de energia cerebral e o estresse oxidativo têm sido associados com algumas doenças que afetam o sistema nervoso central, como as doenças de Alzheimer, Parkinson e Huntington e isquemia cerebral. Por outro lado, a homocisteína tem sido considerada um fator de risco para o aparecimento dessas doenças. No sentido de ampliar o conhecimento das alterações bioquímicas envolvidas na gênese da disfunção neurológica característica da homocistinúria, esse trabalho teve como principal objetivo desenvolver um modelo químico experimental de hiperhomocisteinemia em ratos. Utilizando esse modelo, verificamos a atividade da Na+,K+-ATPase e alguns parâmetros de metabolismo energético (produção de CO2, captação de glicose, produção de lactato e atividades das enzimas succinato desidrogenase e citocromo c oxidase) em hipocampo de ratos. A aprendizagem e a memória na tarefa do labirinto aquático de Morris foram avaliadas em ratos submetidos ao modelo químico experimental de hiperhomocisteinemia. Nesse trabalho, também estudamos o efeito in vitro dos metabólitos acumulados na homocistinúria, homocisteína e metionina, sobre a atividade da Na+,K+-ATPase e sobre alguns parâmetros de metabolismo energético (produção de CO2, captação de glicose, produção de lactato e atividade da enzima citocromo c oxidase). Além disso, o efeito in vitro da homocisteína sobre alguns parâmetros de estresse oxidativo (potencial antioxidante total (TRAP), substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS) e atividades das enzimas antioxidantes catalase, superóxido dismutase e glutationa peroxidase) em hipocampo de ratos foi investigado. O tratamento crônico foi realizado do 6o ao 28o dia de vida, através de administrações subcutâneas de homocisteína, duas vezes ao dia, com intervalos de 8 horas. As doses de homocisteína administradas foram escolhidas com o objetivo de induzir concentrações plasmáticas de 0,4 a 0,5 mM, semelhantes àquelas encontradas em pacientes homocistinúricos. Através desse tratamento, também foram induzidas concentrações elevadas de homocisteína no cérebro de ratos. Os controles receberam solução salina em volumes semelhantes. Os resultados mostram que a administração crônica de homocisteína inibiu a atividade da Na+,K+-ATPase de membrana plasmática sináptica, a produção de CO2 e a captação de glicose, assim como as atividades das enzimas succinato desidrogenase e citocromo c oxidase em hipocampo de ratos. Os animas tratados com homocisteína também apresentaram diminuição de memória na tarefa do labirinto aquático de Morris. Além disso, a homocisteína e a metionina inibiram a atividade da Na+,K+-ATPase de hipocampo de ratos in vitro. Estudos cinéticos sobre a inibição da Na+,K+-ATPase, causada pela homocisteína, também foram realizados. Os resultados mostraram que a homocisteína inibe a enzima de forma não-competitiva com o ATP como substrato. Também foi verificado que a incubação de homogeneizados de hipocampo com homocisteína diminuiu a atividade da Na+,K+-ATPase e que a incubação simultânea com alguns antioxidantes, tais como glutationa, ditiotreitol, cisteína e a enzima antioxidante superóxido dismutase preveniram esse efeito. Os metabólitos acumulados na homocistinúria também alteraram alguns parâmetros de metabolismo energético cerebral (produção de CO2 e lactato, captação de glicose e atividades das enzimas succinato desidrogenase e citocromo c oxidase) in vitro. Além disso, verificou-se que a homocisteína in vitro diminuiu o TRAP e aumentou a quantidade de TBARS, um marcador de lipoperoxidação, mas não alterou as atividades das enzimas antioxidantes catalase, superóxido dismutase e glutationa peroxidase. Os achados sugerem que a inibição da atividade da Na+,K+-ATPase, a diminuição do metabolismo energético e o aumento do estresse oxidativo podem estar relacionados com as disfunções neurológicas características dos pacientes homocistinúricos.

Indicadores biológicos e manifestações de neurotoxicidade em agricultores com exposição crônica a níveis baixos de pesticidas organofosforados

A exposição crônica a níveis baixos de pesticidas é acompanhada por processos adaptativos orgânicos responsáveis por quadros de tolerância, onde manifestações clínicas e laboratoriais perdem a sua validade como parâmetro de exposição. Na amostra foram analisados 25 trabalhadores rurais na região central do Estado do Rio Grande do Sul, de ambos os sexos, com idade de 37 ± 13 anos, investigados em dois momentos: durante e no intervalo de aplicação de pesticidas. Os resultados evidenciaram exposição diária aos produtos (durante 17.8 ± 11.8 anos) e baixo índice de utilização de Equipamentos de Proteção Individual. Em vigência da exposição, foram identificados sintomas extrapiramidais significativos em 12 indivíduos, medido pelo escore total de parkinsonismo (ESRS). Mesmo que este número tenha diminuído após 3 meses da exposição aos OPs, 9 indivíduos permaneceram com o escore elevado. Este número é significativo, levando-se em conta a faixa etária da população investigada. Da mesma forma, o número de diagnósticos psiquiátricos Axis I durante a exposição aos OPs foi mais prevalente que o esperado, principalmente relacionados à ansiedade e depressão. Durante a exposição, 18 pacientes (48%) apresentaram diagnóstico de ansiedade generalizada e 8 (21%) de episódios de depressão maior. Na III entrevista que correspondeu ao período de exposição, 11 indivíduos apresentaram 24 diagnósticos psiquiátricos. Na segunda entrevista (sem exposição), este número foi reduzido para 7 pessoas com um total de 11 diagnósticos psiquiátricos. Entre os indivíduos que completaram ambas as avaliações (durante e no intervalo da exposição), o total de diagnósticos psiquiátricos foi reduzido de 24 para 13 e houve decréscimo no número de indivíduos com qualquer diagnóstico psiquiátrico, de 11 para 7, que é próximo ao esperado para grupos locais, de acordo com dados epidemiológicos realizados no Estado do RS. A medida da atividade da acetilcolinesterase não apresentou diferença significativa quando comparados os dados obtidos em presença e fora da exposição. No estudo, 52% dos trabalhadores desenvolveram episódios anteriores de intoxicação e, no momento da avaliação, apresentavam índices elevados de efeitos extrapiramidais e de diagnósticos psiquiátricos (depressão e ansiedade). Estes fatos conduzem para neurotoxicidade que envolve o uso destes compostos, mesmo que transitória, e determina a necessidade de busca de parâmetros indicativos de intoxicação a compostos potencialmente neurotóxicos, em indivíduos submetidos a exposições prolongadas a baixas doses. Dados adicionais da investigação consistiram no estudo dos níveis plasmáticos das proteínas S100B (marcadora de lesão de astrócitos) e da enolase específica de neurônios (NSE), em 24 agricultores, obtidos durante e no período pós-exposição aos pesticidas organofosforados. No estudo, não houve diferença significativa nos níveis plasmáticos da proteína S100B, quando comparados os dois momentos. Entretanto, IV estes mesmos indivíduos apresentaram diferença nos níveis plasmáticos da NSE, mostrando-se mais elevada no período correspondente ao pós-exposição, quando comparados ao mesmo grupo, durante a exposição, e ao controle. Uma hipótese proposta pelos autores consiste na possibilidade de que a elevação da NSE, após término da exposição aos OPs, reproduza os fenômenos observados em quadros de isquemia cerebral, onde é observada morte neuronal tardia.

Efeito in vitro das substâncias acumuladas na doença de Lesch-Nyhan sobre a atividade da Na+,K+-ATPase em estriado de ratos

A doença de Lesch-Nyhan é um erro inato do metabolismo das purinas caracterizado pela deficiência na enzima hipoxantina- guanina fosforibosiltransferase. O bloqueio dessa reação resulta no acúmulo tecidual de hipoxantina, xantina e ácido úrico. A doença caracteriza-se por hiperuricemia, variado grau de retardo mental e motor, espasticidade e auto-mutilação. No sistema nervoso central, a Na+, K+ - ATPase é responsável pela manutenção da homeostase dos íons Na+ e K+, regulando o volume celular, a excitabilidade neuronal, o transporte de neurotransmissores e outras moléculas. Evidências na literatura demonstram que a redução na atividade da Na+, K+ - ATPase está relacionada com diversas doenças neurodegenerativas, tais como isquemia cerebral e doenças de Parkinson e de Alzheimer. No presente estudo, investigamos o efeito in vitro da hipoxantina, xantina e ácido úrico sobre a atividade da Na+, K+- ATPase em membrana plasmática sináptica de estriado de ratos. Estudamos, também, a cinética de inibição causada pela hipoxantina e de interação entre hipoxantina, xantina e ácido úrico. Nossos resultados demonstram que hipoxantina, xantina e ácido úrico inibem significativamente a atividade da Na+, K+- ATPase. O estudo dos mecanismos de inibição da atividade enzimática causados pela hipoxantina demonstrou um efeito inibitório não competitivo com o substrato ATP. Além disso, o estudo de interação cinética entre hipoxantina, xantina e ácido úrico sugere que esses compostos atuem em um mesmo sítio de ligação na enzima. Verificamos, também, o efeito da preincubação de homogeneizado de estriado de ratos na presença de hipoxantina (10 µM) sobre a atividade da Na+, K+- ATPase de membrana plasmática sináptica com a adição ou não de antioxidantes (glutationa e trolox), bem como alguns parâmetros de estresse oxidativo denominados TBARS (medida de lipoperoxidação) e TRAP (capacidade antioxidante tecidual não-enzimática) no intuito de verificar a participação do estresse oxidativo nos mecanismos de inibição enzimática provocados pela hipoxantina. Os resultados monstraram que a hipoxantina inibe significativamente a atividade da Na+, K+- ATPase. Adicionalmente, nossos resultados demonstraram que glutationa, mas não o trolox, na concentração de 1 mM, foi capaz de prevenir a inibição enzimática causada pela hipoxantina. Nossos resultados também mostraram que a hipoxantina, na mesma concentração, aumentou TBARS e diminuiu TRAP que essa substância induz o estresse oxidativo. É possível que a inibição na atividade da Na+, K+- ATPase possa estar envolvida nos mecanismos pelos quais as oxipurinas são neurotóxicas. Acreditamos que nossos resultados possam contribuir, pelo menos em parte, na compreensão da disfunção neurológica encontrada em pacientes portadores da doença de Lesch-Nyhan.